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日本长崎大学案例分享 - 轮状病毒密度梯度纯化

发布时间:2021-04-22 17:20 |  点击次数:

近年来,在病毒研究中,使用商业试剂盒纯化和分析基因组并从样品中鉴定病毒已成为一种标准做法。 由于已建立病毒的基因组,即使在混合样品状态下也可以进行病毒鉴定。 但是,要对病毒的进行更详细研究时,首先必须得到高度纯化的病毒颗粒。本文将介绍日本长崎大学中尾修教授(Osamu Nakagomi)基于超速离心纯化病毒的经验分享。


日本长崎大学中尾修教授及分子流行病学实验室的工作人员


背景

中尾修教授团队的研究和专业领域是轮状病毒的分子流行病学。轮状病毒 A 已成为全世界婴幼儿急性脱水腹泻导致死亡的首要杀手。直到 1970 年代,婴儿腹泻的原因几乎是完全未知的。随着 1973 年轮状病毒的发现,它最终被确定为占腹泻儿科病房患者的一半病因,这是病毒研究中的一个划时代的发现。在克服许多障碍之后,轮状病毒疫苗于 2006 年开发并获得许可,世界卫生组织在 2009 年建议在世界上每个国家的国家免疫计划中引入轮状病毒疫苗。

简单介绍一下轮状病毒:一种非包膜病毒,由包含 11 个双链 RNA 片段的基因组组成(图 1)。像其他 RNA 病毒一样,它迅速进化并显示出丰富的基因组多样性。它不仅感染人类,还感染其他多种哺乳动物和鸟类。在 1980 年代,中尾修教授团队首次采用分子流行病学技术进行了全基因组水平的分析并得以确定动物轮状病毒可以致病,并且实际上可以引起人类疾病。阐明轮状病毒在以人类和其他动物为宿主的过程中如何进化,感染如何传播,随着疫苗的广泛使用可能发生的变化是其研究工作的核心。


图 1

左边:完整的轮状病毒颗粒具有由红色和蓝色蛋白质制成的外壳,具有三层结构,因此称为三层粒子(TLP); 如果将外壳剥掉,则会保留带有蓝色蛋白质的双层颗粒(DLP)。

右边:轮状病毒的基因组 RNA 分为 11 个片段(电泳显示的特征条带)


超速离心病毒纯化方法概述

在提取并研究病毒基因组时,必须首先纯化病毒颗粒,而超速离心在该过程中起着重要作用。纯化的病毒颗粒可以从一开始就确保正在处理病毒颗粒中的轮状病毒基因组。实际上,在超速离心中考虑了浮力密度,大小和沉降系数(Svedberg 值,S 值)等信息,这也是病毒学的基本方面,它们被称为病毒的理化特性。

在纯化从病患获得样品中的轮状病毒时,必须从复杂的细胞器,生物大分子中进行分离。因为这些颗粒具有不同尺寸和密度,便可基于利用「蔗糖密度梯度离心法」和「氯化铯密度梯度平衡离心法(密度平衡)」的「二维纯化组合」实现病毒纯化。图 2 中展示了条带密度(密度梯度离心过程中出现条带的密度)与 S 值之间的关系。病毒正好位于各种细胞颗粒(包括微粒体和核糖体)之间的缝隙中。病毒是蛋白质(主要具有 1.3 g / cm3 的浮力密度)和核酸(主要具有 1.7 g / cm3 的浮力密度)的复合物,因此浮力密度范围为 1.35–1.4 g / cm3。另一方面,病毒的大小达到 100-1,000S 值。微粒体部分的 S 值与病毒的 S 值(水平轴)重叠,但是可以通过其不同密度(垂直轴)分离。因为包含核酸,病毒馏分比微粒体馏分具有更高的密度,同时,病毒越大,其 S 值越大。超速离心涉及通过结合这两个理化性质参数进行纯化。


图 2. 病毒/细胞器密度和 S 值 1

虽然病毒大小可用电镜可靠地确定,但是如果存在新的病毒株,那么辨别离心后病毒将停留在何处就很重要。例如,如果使用 Avanti J 系列高速冷冻离心机 10,000 rpm 过夜离心后,流感和中等大小 100 nm 轮状病毒会沉淀。但是,大小为 30 nm 的诺如病毒不会沉淀,离心机的选择对于辨别这些理化特性非常重要,在这种情况下,则必须使用 Optima 超速离心机。

此外,在处理体积方面,需按从最大到最小顺序考虑以下方法:差速离心+缓冲法(cushion)和密度梯度法。缓冲法允许 60-70% 的试管充满样品,但在密度梯度离心中体积减小到 10-15%。因此,在使用密度梯度法确定了颗粒的行为特征之后,则可使用了缓冲法来处理更大体积的样品。例如,轮状病毒颗粒穿过 30% 的蔗糖层,但不会穿过 70% 的蔗糖层,因此病毒可以集中在 30% 和 70% 的蔗糖层之间的界面(图 3)。



轮状病毒超离纯化方法介绍

a. 选择定角转子还是水平转子?

若比较产生相同离心力的转子,则固定角度转子可处理更大的体积,并且更易于使用。 

但如果要充分回收密度梯度离心法产生的条带,水平转子更优。 定角转子的离心时沉淀通常会在侧壁表面留下痕迹,由于当下实时 PCR 的检测灵敏度有所提高,因此有必要考虑以前可能被忽略的污染水平。

因此,一般而言,如果需要更大的体积处理量,应选择定角转子,而如果污染是一个主要问题,则应该使用水平转子。

b. 样品制备方法

从感染性培养液(ICF)中纯化轮状病毒为例说明样品制备步骤。由于纯化的病毒颗粒的产量大致与起始体积成正比,因此最好使用 1 升 ICF。在使用高速冷冻离心机达到一定程度的浓缩后,再使用落地式超速离心机配合水平转子 SW 32 Ti 或 SW 55 Ti 对其进行进一步浓缩和纯化。图 3 是从 ICF 中纯化轮状病毒的方案。

首先,为了消除细胞碎片,将 1 升 ICF 分成 6 个瓶,使用 JA-14 固定角度转子以 15,000 xg 的速度离心 10 分钟。可以省略此步骤,但如果这样做,则在下一步中使用缓冲垫方法进行超速离心过程中会存在更多的杂质。预处理越多,后续操作就越容易和清洁。此外,如果存在大量杂质,病毒会渗入其中,这可能会降低产量。

除去细胞碎片后,使用 JA-14 定角转子将剩余的上清液以 30,000 xg 的速度进一步离心 14-16 小时,以得到病毒沉淀。如果急于使用,可以采用超速离心机,并使用 Type 45 Ti 定角转子一次处理 300 mL - 可以将这些样品以 30,000 rpm 的速度快速离心 2 小时,或者以 40,000 rpm 的速度快速离心 1.5 小时。

接下来,将沉淀物悬浮于 26 mL 磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。决定将颗粒悬浮在多少体积的 PBS 中需要经验和直觉。通常,在每个纯化步骤中浓缩液的浓度比例均不宜超过 1:10。例如,如起始原料为 1 升,则不应浓缩至 100 毫升以下;否则,则生成的产品会浑浊。

c. 使用超速离心机进行分离

接下去可以使用具有大容量 SW 32 Ti 水平转子的蔗糖缓冲法进一步去除杂质。轮状病毒颗粒可以集中在 30%(w / v)和 70%(w / v)蔗糖层之间的界面处。为此,在 38.5 mL 超速离心管的底部分配 4.5 mL 的 70% 蔗糖溶液,并在顶部分配 6.5 mL 的 30% 蔗糖溶液层,然后加入 26 mL 的病毒悬浮液 (PBS 中)。在图 3 所示的条件下完成超速离心后,杂质将在 30% 蔗糖溶液层上方大量聚集,而轮状病毒颗粒将在 70% 和 30% 蔗糖缓冲层之间聚集并显示为白色条带。可以通过穿刺取样的方式收集该条带。

为了进一步提高纯度,可以进一步使用小容量 SW 55 Ti 水平转子进行密度梯度离心。为此,在 5 mL 超速离心管的底部分配 55%(w / v)的氯化铯溶液,然后用等量的 40%(w / v)的氯化铯溶液覆盖。(即使只有两层,在超速离心后自然也可以形成密度梯度。)然后将从上一步缓冲法(在这种情况下,最好使用少量溶液)获得的 0.5-0.8 mL 粗病毒馏分铺于氯化铯溶液上,并以 257,000 xg 进行 16-20 小时超速离心。

如图 3 所示,试管中有两个可见的轮状病毒带。上部带包含 1.36 g / cm3 完整轮状病毒三层颗粒(TLP),下部带包含 1.38 g / cm3 双层颗粒(DLP),其中剥去了外壳。病毒颗粒包含 RNA。 DLP 的蛋白质少于 TLP。因此,核酸的比例更高,因此更重。上方的蓝色条带是仅由不含核酸的蛋白质组成的空颗粒,由于它们是蛋白质,因此浮力密度约为 1.3 g / cm3。实际上,当除去 TLP 的外壳以露出 DLP 时,RNA 聚合酶被激活。在涉及 RNA 聚合酶的实验中,使用了去除外壳的 DLP 轮状病毒。